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干货来袭|单细胞全长转录组测序研究方案
发布时间:2023-11-17

10× Genomics单细胞转录组已“飞入”各个研究领域,虽然该方法可以定量描述基因的表达水平,但随着研究的深入,二代短读长测序已无法检测到转录本的全长结构,因此无法准确挖掘到可用于揭示细胞类型特异性的转录本异构体、融合基因和新的驱动突变等信息,满足不了研究人员对于更加精细、更加深入的科学的探索。

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基于三代测序平台的单细胞MAS-ISO-seq技术已被生物科技领域的权威期刊Nature Biotechnology所认可[1],该技术是利用10× Genomics分选后的cDNA进行串联,将其作为一个长的HiFi read进行测序,并将有效数据产量扩大16倍。之后通过PacBio平台,采用CCS(circular consensus sequencing read,环形一致性序列)测序模式进行测序。整个过程无需打断拼接,直接获得包含5',3' UTR,poly A tail的完整转录本。

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安诺优达在PacBio平台进行了大量测试,率先发布了MAS-ISO-seq的实测数据,展示了单细胞水平的转录本异构体分析

安诺优达单细胞全长转录组测序方案采用二代测序+三代测序联用方法,优势互补,不仅可以获得更加精细的细胞聚类、细胞注释,而且还可以挖掘到在肿瘤、系统性疾病、发育生物学等研究中非要重要的可变剪切、融合基因、RNA水平突变等信息。

实验流程介绍

① 分选流程与10× Genomics单细胞转录组兼容;

② 完美适配 10× Genomics 3' 单细胞转录组测序文库制备;

③ 使用全长cDNA串联技术,将HiFi reads利用率提高了16倍;

④ 结合PacBio的Iso-Seq长读长测序可获得全转录本信息;

⑤ 一个文库即可以获得3,000-10,000个细胞表达的RNA信息。

应用领域

肿瘤的发生发展研究;

疾病潜在标志性基因的挖掘;

胚胎、器官发育轨迹的研究;

胁迫响应机制的探究等。

案例分享

接下来为各位老师分享1篇采用二代+三代测序技术在癌症研究领域的经典文献。

文章标题:Detection of isoforms and genomic alterations by high throughput full-length single-cell RNA sequencing for personalized oncology[2]

发表期刊:BioRxiv

发表时间:2022.12

01 研究背景

癌症是一种复杂疾病,基因组和转录组层面各维度的异常都可能参与到驱动肿瘤的形成和演变过程中,包括点突变、插入缺失、基因融合、基因拷贝数变异、可变剪接导致的不同转录异构体等等。除此之外,肿瘤内部的异质性及其与肿瘤微环境(TME)的相互作用,更是提升了其复杂程度。因此,了解癌症的复杂背景需要单细胞分辨率的基因型-表型信息,通过单细胞短读长和长度长测序方式,获得基因表达定量及全长转录本信息。

02 材料选择及测序方法

3个人类高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)患者的3个肿瘤转移样本和2个正常样本;

10× Genomics二代测序,20,000-50,000 reads/cell;

cDNA串联成8-11kb的长片段,三代测序,12,000 reads/cell。

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03 研究结论

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该研究选取了3位HGSOC的肿瘤样本和癌旁配对样本,进行了二代短读长和三代长读长测序。结果发现,两者单独鉴定的细胞类型和种类占比非常相似。其中,长读长测序共识别了152,546个异构体,超过52,000个是新发现的转录异构体,42%具有蛋白编码功能。联合bulk DNA数据,从长读长数据中鉴定到了48个生殖系突变和34个体细胞突变。并且,肿瘤细胞中含有8%的特异性isoforms,远高于正常细胞。在肿瘤细胞和间皮细胞中存在 isoform亚型的差异表达,且转移样本中存在间皮和成纤维细胞之间的转化。以基因IGF1(胰岛素样生长因子)为例,来自所有患者的癌细胞几乎完全使用该基因的第二个外显子作为转录起始位点(II类亚型),而其他细胞主要使用第一个外显子(I类亚型)。此外,在2号肿瘤样本细胞中检测到IGF2BP2:TESPA1的融合,而在对应的短读长数据中被错误的识别为TESPA1的高表达。总体来说,文章展示了单细胞全长转录组技术在肿瘤研究和精准医疗中的应用潜力。

关于安诺优达

诺优达基因科技成立于2012年,一直深耕人类医学健康和生命科学研究两大领域,建立了专业的检测与数据分析平台,积极推动基因科技的产业化应用,助力生命科学发展。安诺优达三代测序中心成立于2017年,配备32台PacBio测序仪,包括2台2023年新引入的PacBio Revio测序仪,日数据产出可达3T。中心已经积累多年的动植物、人类、癌症等样本的测序经验和项目经验,具备高通量大规模的三代测序能力,并实现了数据的高质量产出。

安诺优达三代测序中心已经助力客户在 Cell、Nature、Nature Biotechnology、Nature Plants、Nature Communications、Molecular Plant 等多个期刊发表多篇高分文章。基于丰富的项目经验及平台优势,安诺优达将提供规模增强,通量提升的测序服务,持续满足不同研究项目的个性化需求,为您的科研道路抢占先机,扫平障碍。

参考文献

[1] A. M. Al’Khafaji et al., High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat. Biotechnol., (2023).

[2] A. Dondi et al., Detection of isoforms and genomic alterations by high-throughput full-lengthsingle-cell RNA sequencing for personalized oncology. bioRxiv, 2022.2012.2012.520051 (2022).