染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipition，ChIP）是研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验方法，ChIP与高通量测序的结合（ChIP Sequencing）可以在全基因组范围内对蛋白结合位点进行有效而准确地筛选与鉴定，广泛应用于组蛋白修饰，转录因子调控等相关领域的研究。
| 产品类型 | 测序平台及策略 | 推荐数据量 | 周期 |
| ChIP-seq | NovaSeq 6000 PE150 DNBSEQ-T7 PE150 | ≥20M reads | 40天 |
| 产品类型 | 样品要求 | |
| ChIP-seq | 样品类型 | 无降解且无蛋白和RNA污染的ChIPed DNA样品或对应input DNA样本 |
| 样品需求量 | ≥ 5ng | |
| 样品浓度 | ≥ 0.4ng/μl | |
| 样品纯度 | OD260/280=1.8~2.2 | |
| 其他要求 | 分布在150~500 bp范围，主峰在200-300 bp之间且主带明显，需要老师提供检测结果 | |
星形胶质细胞通过向神经元提供多种物质与邻近神经元相互作用，而星形胶质细胞如何通过改变神经元的代谢状态来调节神经功能仍然是未知的。本研究表明，星形胶质细胞载脂蛋白 E（ApoE）中具有多种 miRNAs，这些 miRNAs特异性地抑制了参与神经元胆固醇生物合成的基因，最终导致了通路起始底物乙酰辅酶 A的积累，从而促进神经元组蛋白乙酰化和相关基因的转录激活。在功能上，ApoE 介导的神经元组蛋白乙酰化导致多个神经元即时早期基因启动子中 H3K27ac 的富集，从而增强小鼠的记忆巩固。星状细胞载脂蛋白介导的神经元表观遗传机制，可以作为星形胶质细胞调节大脑连接和功能的一种新手段。
为了研究星形胶质细胞如何调节神经元功能，我们首先使用星形胶质细胞衍生培养基（ADM）和对照培养基（CTRL）处理体外培养的神经元。GO富集分析结果显示， 显著下调的基因显著富集于胆固醇/固醇生物合成过程相关的 GO term，这表明胆固醇的生物合成受到抑制。qPCR和 WB表明 ADM处理显著降低了神经元中胆固醇生物合成途径的 8种酶的水平。在 ADM诱导下，HMGCS1、HMGCR和 CYP51的减少最为明显。
图：ADM处理后差异表达基因富集的 GO term
通过 WB检测到 ADM中有大量 ApoE，用 ApoE处理的神经元也显示了胆固醇生物合成的显著下调。HMGCR、HMGCS1和 CYP51水平同样显著降低。同位素标记实验显示，ApoE处理的神经元中甾醇比例显著降低，且抑制了神经元中胆固醇的从头合成。ApoE的表达受到抑制时，ADM处理下 HMGCS1、HMGCR和 CYP51的水平也基本维持不变，胆固醇生物合成酶轻微减少。ApoE进入神经元主要是通过受体介导的配体结合诱导的内吞作用，用 ApoE受体拮抗剂受体蛋白阻断 ApoE的内噬作用，在神经元中没有观察到胆固醇生物合成途径活性的显著降低。综上所述，星形细胞来源的 ApoE可以抑制神经元中的胆固醇生物合成途径。
图：ApoE抑制神经元中胆固醇的生物合成
由于乙酰辅酶 A是胆固醇生物合成的前体，所以对神经元乙酰辅酶 A的水平进行评估，ApoE导致乙酰辅酶 A与游离辅酶 A的比例显著增加。乙酰辅酶 A是组蛋白乙酰化的主要供体，乙酰辅酶 A的核水平和组蛋白乙酰化存在直接联系。ApoE处理的神经元中大量基因表达上调，提示组蛋白乙酰化可能参与了基因表达的控制。接下来探究 ApoE对神经元组蛋白乙酰化的影响，发现组蛋白赖氨酸残基的一般乙酰化水平显著升高。H3K9ac、H3K27ac、H4K5ac、H4K12ac等组蛋白乙酰化标记水平升高，这些标记均位于活性基因启动子上，已知具有促进转录的作用。RNA-seq分析也显示，ApoE处理的神经元 mRNA水平显著升高。因此，星形细胞 ApoE调控神经元中的组蛋白乙酰化和转录激活。
图：星形胶质细胞 ApoE促进神经元组蛋白乙酰化
接下来，我们研究 ApoE中的哪些成分是导致神经元胆固醇生物合成途径活性降低的原因。由于 ApoE富含胆固醇，使用与 ApoE重组蛋白结合的胆固醇在体外形成脂蛋白复合物处理神经元，或者使用胆固醇隔离剂去除神经元的胆固醇，这些操作都没有影响三种胆固醇生物合成酶的水平。此外，ApoE含有丰富的 miRNA，外源重组 ApoE蛋白（不含 miRNA）没有改变神经元胆固醇生物合成途径活性或组蛋白乙酰化水平。放射性嘧啶标记检测显示，ApoE被星形胶质细胞分泌并吸收到神经元中，证实 RNA可通过 ApoE从星形胶质细胞传递到神经元。敲低星形胶质细胞中参与 miRNA合成的必需酶，显示 ApoE失去降低神经元胆固醇生物合成途径活性的能力和组蛋白乙酰化水平。此外，RNase- A/T 处理的 ApoE也可以抑制胆固醇合成和促进组蛋白乙酰化，表明 ApoE的 miRNA没有暴露在 ApoE的表面。Dicer CKO小鼠海马区神经元 HMGCR水平显著升高，而神经元乙酰辅酶 A和组蛋白乙酰化水平显著降低，MAP2和 PSD95的水平降低。综上，星形细胞来源的载脂蛋白载体 miRNA 可调节神经元中的胆固醇代谢和组蛋白乙酰化。
图：星形胶质细胞 ApoE介导多种调节性 miRNA进入神经元
进一步对存在于 ApoE、神经元中的 miRNA进行了分析。我们推测，ApoE的 miRNA 可能在转录后调控神经元基因表达，所以主要关注那些在颗粒中富集明显高于神经元的miRNA。测定了ApoE与受体神经元中差异表达最高的40个miRNA，TargetScan 分析表明，22 个 miRNA 靶向胆固醇生物合成酶的转录本。在这些 miRNA 中，miR-126-5p （miR-126）在人类和鼠中保守且大量表达，并且和 HMGCR的 3’UTR区域有 2 个结合位点。所以选择 miR-126 进行进一步研究。qPCR 分析显示，ApoE 中的 miR-126水平显著高于星形胶质细胞或神经元，荧光素酶实验显示 miR-126直接与 HMGCR mRNA的 3’UTR结合。敲低 miR-126显示神经元细胞胆固醇生物合成通路活性降低。综上，含有多种 miRNA的 AopE可以参与多种胆固醇生物合成基因的转录后调控，具体表现为沉默其表达。
图：ApoE中的 miRNA 及其调控的胆固醇生物合成酶的靶基因
图：miR-126功能验证
海马体与啮齿动物和人类的认知功能密切相关，ApoE基因敲除导致显著的学习和记忆缺陷，而 miR-126 KD 小鼠的认知功能受损。组蛋白乙酰化的染色质重塑与长期记忆的形成有关，评估了 ApoE 通过组蛋白乙酰化在记忆巩固中的作用。情境性恐惧条件反射（FC）训练结果显示 ApoE KD小鼠和 miR-126 KD小鼠海马神经元核中乙酰辅酶 A /辅酶 A和组蛋白乙酰化水平明显降低。说明在记忆巩固过程中，ApoE通过 miRNA 介导的机制重塑组蛋白乙酰化。记忆的巩固依赖于突触的强化，而突触的强化需要整体的转录激活，特别是 IEGs。RNA-seq 显示在接受 FC 训练的对照组小鼠中，大多数报道的 IEGs 转录增加，而 ApoE 缺乏未能诱导这些 IEGs 达到在对照组小鼠中观察到的水平。
图：ApoE促进神经元乙酰辅酶 A /辅酶 A和组蛋白乙酰化水平
接下来我们研究了 ApoE是如何激活这些 IEGs的转录的。H3K27乙酰化的全基因组ChIP-seq分析表明，在 FC训练的对照组小鼠海马中，H3K27ac标记优先定位于这些小鼠转录起始位点（TSSs）上游 2 kb的区域，ApoE的缺乏会大大削弱这些 IEGs 启动子区域的 H3K27ac。说明记忆巩固相关基因表达是通过 ApoE介导的组蛋白乙酰化变化来调控的。综上，星形胶质细胞 ApoE通过促进染色质上活性组蛋白标记的乙酰化来促进神经元功能，有利于记忆巩固的基因的转录激活。
图：ApoE促进 IEGs启动子区域 H3K27ac
为了研究人类 ApoE 亚型在调节神经元胆固醇代谢和组蛋白乙酰化方面是否有不同的功能，使用 ApoE4 或 ApoE3 处理培养的神经元。ApoE4 在降低神经元胆固醇生物合成酶和促进组蛋白乙酰化方面的能力较差。进而探究 ApoE 是否通过组蛋白乙酰化以一种亚型特异性的方式调节记忆巩固。ApoE4 TR小鼠经 FC训练后，乙酰辅酶A/辅酶A和组蛋白乙酰化水平均显著低于ApoE3 TR小鼠。ChIP-qPCR显示ApoE4 TR小鼠中 H3K27ac在 Fos、Arc和 Egr1启动子区域的富集程度低于 ApoE3 TR小鼠。这表明 ApoE4 小鼠巩固恐惧记忆的能力较差。此外 ApoE4 中 miR-126 的富集程度明显低于 ApoE3 颗粒。综上，表明 ApoE4 在神经元胆固醇代谢和组蛋白修饰方面不如 ApoE3有效。
图：人体内 ApoE3在记忆巩固中发挥更大作用
[1] Li X , Zhang J , Li D , et al. Astrocytic ApoE reprograms neuronal cholesterol metabolism and histone-acetylation-mediated memory[J]. Neuron, 109(6):957-970.e8.
