宏转录组测序是指以环境中微生物的全部RNA为研究对象，从整体水平上研究某一特定环境，特定时期群体生命全部基因组转录情况以及转录调控规律；也即从转录水平研究复杂微生物群落变化，研究各个微生物成员对整体环境的贡献，即各微生物的功能和功能间的相互作用所带来的调控机制。相较于宏基因组，宏转录组能从转录水平研究复杂微生物群落变化，能更好的挖掘潜在的新基因、差异表达的基因及其功能以及代谢通路的构建。

结肠炎病症中宿主和微生物互作过程中微生物转录响应机制

Defining the microbial transcriptional response to colitis through integrated host and microbiome profiling

实验设计及样本处理见图.1a。在结肠炎诱导的第14天，H. hepaticus+aIL10R 小鼠的炎症的特征相对于H. hepaticus alone, aIL10R alone, steady state control groups（无处理组）表现出更显著的病症fig.1b。宏基因组数据表明优势物种有 Firmicutes (mean 56% (34–76%))和 Bacteroidetes (mean 29%(11–48%)) phyla, 和其它的物种 Proteobacteria (mean 9% (7–15%)) 和 Actinobacteria (mean 3% (2–6%))。四个门物种的数据占了约97%的数据，宏转录组数据表明优势物种是 Firmicutes (mean 78% (63–87%))和 Bacteroidetes (mean 12% (4–25%),两个物种一起贡献了90%的序列。和 Proteobacteria 、 Actinobacteria分别贡献了 6% (5–10%) 和2%(1–2%)。这些数据确认了群落中活跃的物种，Firmicutes 在转录层面占了大多数。在属层级上，宏基因组数目主要有优势属和其它更低丰度的物种组成 (Figure 1c)，与宏转录组的物种组成特征类似(Figure 1d)。Bacteroides (mean 22% (8–37%)), Clostridium (mean 12% (6–18%)), Eubacterium (mean 12% (6–19%)), Roseburia (mean 6% (3–9%)), Lactobacillus (mean 4% (2–9%)), Blautia (mean 5% (2–7%)) and Escherichia (mean 1% (0.4–6%)) 贡献了50%的assigned reads,另外有 896 低丰度的属 (＜5% assigned reads) 组成了剩下的物种结构(Figure 1e)。Eubacterium 和 Clostridium 是小鼠肠道宏转录组数据中占优势的物种。

图1 不同样本间的微生物群落结构比较

为了发现并评估该模型中的微生物群落结构和转录后行的变化，采用宏基因组和宏转录组联合分析的方法。使用属层级上的宏基因组数据发现H. hepaticus+aIL10R组与其它组在多样性和richness上午显著的差异。宏基因组和宏转录组数据库在检测到的属层级上有很强的overlap(Figure 2a)，在低丰度的属上的不同分布也是如此(Figure 2b)。在DNA丰度上确认转录活性的依赖性上，作者发现在两个数据库中检测到属的DNA和RNA丰度有很强的关联性(Figure 2c)。尽管在该模型中，作者引入了外源的致病菌（H. hepaticus），但它的出现和消失没有推动结肠炎、aIL10R treated、未处理组的聚类（Figures 2d, e)，这些数据与H. hepaticus低丰度的raeds相一致，反映出结肠并不是H. hepaticus的最初定植部位。为了评估结肠炎中的群落组成和转录活性的变化，作者选取了在RNA 和DNA data sets中RPM＞0.1的属物种。PCA分析显示3/4的结肠样本（steady state, H.hepaticus alone and aIL10R groups)的群落结构和群落转录后行都有很显著的差异。作者同时观察到在属转录水平上的88个属有显著的差异（48个上调、40个下调），在两个数据库中增加和减少显著富集的属在所有样本中都有最大的fold(Figures 2g–j)，确认了在两个数据库中转录水平出现了同等的变化。与属转录水平一致，这些转录增加的菌包括多种lactic acid bacteria（LAB）菌：Pediococcus, Weissella, Lactococcus, Enterococcus 和 Streptococcus (Figure 2k)。

 图2 结肠炎和未处理的属层级上差异丰度情况

利用宏基因组和宏转录组学的方法，作者试图寻找微生物的功能蛋白和这些功能的转录活性，并结合从这些数据库中的属等物种，功能基因以eggNOG functional categories 为主。宏基因组数据库中最多的是replication, recombination and repair(mean 12% (11–13%))，接下来是 carbohydrate transport and metabolism (mean 8% (8–9%)), cell wall/membrane/envelope biogenesis (mean 6% (6–6%)), amino acid transport 和 metabolism (mean6% (5–6%)), translation, ribosomal structure and biogenesis (mean 5% (4–5%)) 和 signal transduction mechanisms  (mean 4% (3–6%); （Figure 3a)。宏转录组数据库中reads最高比例的是carbohydrate transport 和 metabolism (mean 14%(11–18%),接下来是 translation, ribosomal structure 和 biogenesis (mean 9% (6–14%)), energy production 和conversion (mean 8% (6–8%)),replication, recombination 和 repair (mean 6%(5–8%)), cell motility (mean 6% (3–11%)), amino acid transport 和metabolism (mean 6% (5–7%))和 post-translational modification, protein turnover, chaperones (mean 5% (3–10%); Figure 3b)。给定的功能的DNA丰度是由编码该基因的物种数目和丰度决定的，而RNA丰度则由取样时的功能重要性（取样时的状态）所决定。因为不令人吃惊的是：replication, recombination and repair是DNA层级上丰度最高的，因为该category是普遍存在的，＞70%的属都至少表达一个NOG （Figure 3c）。这种情况并不能直接反映在RNA水平上，这表明至少在取样阶段复制功能并不是最主要的转录活性。在carbohydrate transport and metabolism category中的NOGs是广泛的表达的(~60% 的属至少表达一个NOG)，这很有可能是该群落的重要功能，特别是这些树是高丰度的。事实上，在表达最高的NOGs中有glycoside hydrolases (α- andβ-galactosidases, α- and β-glucosidases)，这些是Eubacterium, Clostridium, Bacteroides和 Roseburia (Figure 3d)的主要表达产物，反映出这些菌的主要功能是分解复杂的膳食碳水化合物。

图3 使用宏基因组小鼠肠道的功能profiling

宏转录数据中所有的NOGs都能够在宏基因组数据库中被鉴定都(Figure 4a)。这些从DNA数据中分析得到的NOGs是低丰度的(Figure 4b)，这也可能表示某些NOGs低于宏转录组数据库中的检出限。作者深入的分析了两个数据(n = 14 211)中RPM＞0.1的NOGs，发现两者有很强的关联性，尽管属层级上的丰度不同，NOG-level DNA丰度不能完全预测转录丰度(Figure 4c)。 采用PCA分析结肠 炎和非结肠炎样本的 NOG转录聚类情况，分离的非常明显 。

考虑到对照组的聚类情况，作者关注稳态组和 H. hepaticus+aIL10R组 NOGs的丰度差异。丰度差异分析表明在结肠炎中发现了1221和669个显著丰度差异(metagenomics) 和表达的 (metatranscriptomics)(Figure 4f）。结肠炎中DNA和RNA水平上增加的基因显出显著富集的趋势，这些基因参与inorganic ion transport 和 metabolism (Figure 4g）。丰度差异的NOGs参与多种不同的生物学过程(Figure 4h),包括L-cysteine (COG0369),通过peroxidase activity（过氧化氢酶活性）(COG1858, COG2837)或者 DNA protection(COG0783), microcin transport (COG4174 和COG4239)以及nutrient transport (NOG09795, NOG124943 和 bactNOG13045) 来拮抗氧化应激环境。有意思的是半胱氨酸代谢通路的增加（谷胱甘肽的前体），这与人类IBD中推断的功能相一致，与炎症中谷胱甘肽的抗氧化性质密切相连(Morgan et al.,2012)。值得注意的是，除了源自Akkermansia, Escherichia, Erwinia, Staphylococcus (Figure 4i) 的半胱氨酸合成外，作者也观察到glutathione spermidine syntheses (COG0754) 和 glutathione-S-transferase (COG0435) 的DNA和转录丰度相助增加。这些酶类对于维持氧化还原环境和调控依赖谷胱甘肽过氧物酶活性很重要。利用replication 宏转录组数据库，作者证明了NOG转录丰度的可重现性和(Figure 4j; r = 0.92) 并确认了源于宏转录组数据库的458/652 (70%)代谢通路的变化 (Figure 4k) 可以被找到。

这些数据加上之前的研究成果（人类IBD中增加的代谢通路与氧化已经和养分转移）表明：这些代谢通路在转录水平也发生了变化。作者也显示了导致发病的多种的机制，也就是哪些微生物物种在验证环境中长期存在。

图4 DNA和转录层级上丰度差异的NOGs鉴定

从整体上看，DNA丰度上的NOG的变化能够预测转录层面上的NOG变化(R2=0.57，Figure 5a)。然而有些NOGs的转录水平变化比DNA水平上预测的变化更大，而这些NOG可能是微生物对于炎症响应（colitis-responsive）的重要功能基因。因此，作者定义了炎症响应（colitis-responsive）NOGs：假如它们在结肠炎中（DNA 或 RNA）中是显著增加/减少的，采用DNA log²(fold change)和 RNA log2(fold change)作为predictor 和因变量 (dependent variables)，落在线性回归模型的95%的置信区间外的NOG (Figure 5a) 。采用这样的分析方法显示出139个NOGs是增加的并且属于colitis-responsive 的 NOGs。引人注目的是，这些NOGs更倾向于集中在特定的一些物种上，(Figure 5b) 表明某些物种对于变化的环境条件响应更敏感，事实上，这些基因的表达是 Lactobacillus 和 Bacteroides  (Figure 5c)中的主要表达产物。

之前鉴定的NOGs在DNA和转录水平上的丰度更高，这些基因被注释为Dps/ferritin，Fe-dependent peroxidase和glutathione S-transferase-这些基因参与氧化应激的拮抗，并被定义为colitis-responsive(Figure 5a)。在COG0783转录的变化贡献大的属：Dps/ferritin来自LAB的成员 (Enterococcus, Lactobacillus 和Streptococcus),对于 COG2837: 依赖铁的过氧化物酶来自Lactobacillus ；对于COG0435: glutathione S-transferase来自 Brucella (Figures 5d–f)。

这些数据表明在结肠炎环境中丰度较高的功能基因中，参与氧化应激压力抵抗的基因在转录层面上的反应更为显著。

图5 转录上调的、结肠炎响应的NOGs由Lactobacillus 和 Bacteroides占主导地位

本文的目的之一是确定驱动炎症变化的宿主代谢通路，这些可能导致了之前发现的群落结构的变化。作者采用了芯片测序技术在第0天和28天对结肠组织转录响应情况(Figure 6a)。第14天时小鼠出现了炎症的病症最为验证，随着时间的变化，mRNA的调控呈现出截然不同的模式(Figure 6b)。采用k-means 的聚类方法(k = 3)，把差异表达的基因分配到不同的cluster并分析其GO biological functions 所执行的代谢通路。作者发现富集的基因包括在结肠炎发作的第6天时先天性免疫反应发生上调。包括微生物防御在内的基因, 例如 AMPs including S100a8, S100a9,S100a14和Ltf and nitric oxide synthesis (Nos2)。为了说明宿主抗菌性反应对微生物群落的转录层面的可能影响，作者接着评估了源自宏转录组数据推断出来的肠道腔体的宿主基因表达的情况。与结肠炎发病期间的腔体抗菌性活性相一致，在肠道内容物里AMPs S100a8, S100a9, S100a14 and Ltf 和 Nos2 (Figure 6c) 也是显著性的高表达。为了预测促成腔体转录的细胞类型，作者在基因间采用cell-type enrichment analysis来发现增多的细胞类型（cell types）。该分析印证了先天性免疫细胞的存在，例如在腔体炎症中的macrophages（巨噬细胞）和granulocytes（粒细胞(Figure 6d)。依赖TonB的受体(TonB-dependent receptor)成分和源自微生物的并参与抵抗氧化应激的基因在DNA和转录层面增加，这表明这些发生变化的微生物能够抵御金属离子隔离（metal-ion sequestration），这需要通过来自S100a8、S100a9的钙防卫蛋白、肠道腔体中氧化应激响应有关的巨噬细胞和粒细胞来实现。

图6 宿主基因的Luminal表达代表着先天免疫细胞的激活

该研究利用宏基因组和宏转录组首次描述了肠道微生物在结肠炎中的转录响应，并鉴定出关键的功能——在改变的肠道微生态的转录响应中的变化。特别地，参与氧化应激抵抗的NOGs丰度增加，稀有营养成分的摄入和抵御群落中多个微生物物种的AMPs，这些基因特征促进这些微生物在炎症环境中抵抗宿主的先天性免疫反应并有效存活。

Ilott N E, Bollrath J, Danne C, et al. Defining the microbial transcriptional response to colitis through integrated host and microbiome profiling[J]. The ISME journal, 2016.