产品简介 技术流程 样本要求 案例分析 FAQ

技术简介


全长转录组测序(Iso-seq)是指利用三代测序技术对生物体内完整的RNA分子(包括5'末端到3'poly A尾的全长序列)进行测序,RNA分子无需打断,测序可直接获得完整序列。通过全长转录组测序能够更精准地得到转录本信息,可鉴定更多可变剪接位点、新基因和新的异构体、融合基因等。

Connect全长转录组是全长转录组测序(Iso-seq)的升级版,为了充分利用 sequel II测序平台HiFi测序模式下相比之前增加的数据量,安诺研发了Connect全长转录组产品,在建库过程中将多个转录本首尾相连构建SMRTbell文库。通过CCS 测序,一条CCS序列可以拆分得到多条转录本,大幅提升sequel II测序全长 reads 的获得率。



优势


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全长转录组测序应用领域

技术流程

全长转录组测序技术流程

产品参数


全长转录组测序产品参数


样本要求


全长转录组测序样本要求全长转录组测序样本要求

案例解析


全长转录组测序揭示辣椒发育和逆境反应中广泛存在的天然反义转录基因


Full-length mRNA sequencing and gene expression profiling reveal broad involvement of natural antisense transcript gene pairs in pepper development and response to stresses


全长转录组测序揭示辣椒发育和逆境反应中广泛存在的天然反义转录基因


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本项研究利用全长转录组测序提高了辣椒基因组的注释水平,为研究其功能基因组学提供了新思路;分析了NAT基因在辣椒生长过程中的广泛作用以及cis-NAT的进化机制。


设计思路


全长转录组测序设计思路


研究结果


通过PacBio Iso-Seq测序,研究中共获得了57,962条高质量全长转录本,新发现基因5,769个。全长转录组测序的优势之一是可以获得mRNA的完整UTR区域,对与参考基因组拥有相同CDS区域的全长转录本进行分析,新测得的5’和3’UTR分别最高可达100nt和250nt,远远高于参考基因组的平均50nt(图1),这表示全长转录组测序可以捕获更多完整的基因结构。


图1 5’和3’UTR长度分布图


此前辣椒的基因注释主要基于短读长测序,对低表达基因外显子的覆盖度不够,导致一些基因模型的构建呈片段化。本次研究中利用PacBio测序修正了近500个注释错误,使片段化的基因模型趋于完整,被修正的模型多数含有较多的外显子或较长的内含子区域(图2)。


图2 片段化基因模型修正示意图


研究中通过全长转录组测序共获得2057个cis-NAT和5880个基因的34193个trans-NAT,后者55.1%的互补序列都来源于转座子(图3)。通过分析NAT的表达模式,发现它们参与了辣椒的多种生物过程如辣椒素的合成等(图4);同时,对茄科植物进行了cis-NAT特点及进化分析,发现转座子可能参与新的cis-NAT形成(图5)。


图3 trans-NAT基因鉴定


图4 NAT基因表达模式分析图


图5 cis-NAT进化机制分析



研究结论



该研究利用全长转录组测序提高了辣椒基因组的注释水平,在基因组范围内分析了NAT基因的功能和进化过程,为研究辣椒的功能基因组学提供了新思路。


参考文献


Wang Jubin., Deng Yingtian., Zhou Yingjia., Liu Dan., Yu Huiyang., Zhou Yuhong., Lv Junheng., Ou Lijun., Li Xuefeng., Ma Yanqing., Dai Xiongze., Liu Feng., Zou Xuexiao., Ouyang Bo., Li Feng., (2019). Full-length mRNA sequencing and gene expression profiling reveal broad involvement of natural antisense transcript gene pairs in pepper development and response to stresses., Plant J., undefined, undefined.



FAQ


Q相比短读长的RNA-Seq,全长转录组测序有何优势?


A

转录本本身非常多样和复杂,很多基因不符合“一基因一转录本”的模式,它们存在多种剪切形式。基于二代测序的转录组产品需要将RNA打断成小片段进行测序,然后通过信息分析进行拼接组装,但由于受读长限制,转录本在组装的时候会存在较多嵌合体,不能准确地得到全长转录本信息,从而大大降低可变剪接、融合基因等分析的准确性。相比RNA-Seq,基于PacBio测序的全长转录组测序分析,可以更精准地鉴定物种全长转录本信息,从定性的角度,可完善转录本的结构,对全长转录本不同类型的可变剪切事件、新基因/新异构体、可变聚腺苷酸化(APA)、融合基因、ORF、基因变异(SNP和InDel)、转录因子以及lncRNA等元件进行预测与分析。

     

  Q全长转录组测序如何取样?


  A

这主要依据实验目的而定:

1)如果想获得某物种比较全面的转录本信息,建议取不同组织样本混样测序,如植物,建议取根、茎、叶、花、果实等,如动物,建议取肝脏、肾脏、肠、皮肤等部位,提取RNA,等量混合,进行全长转录组测序,得到尽可能全面的表达转录本;

2)如果是对比不同组织、不同处理条件下的转录本差异信息,建议从不同的组织中分别提取RNA进行单独的建库测序,最后通过分析来发现不同样本中的转录本差异;

3)如果要做二三代转录组的联合分析,那在取样时要注意,三代样品虽然不用设置生物学重复,但是需要涵盖二代所有分组的信息,比如二代有多种不同的处理组,可以等量混合成一个三代的样品,进行后续的定量分析。 



  Q全长转录组测序可以分析哪些RNA?


  A

由于全长转录组建库是利用oligo dT法进行反转录合成cDNA,因此只能检测带polyA的RNA。



  Q

Connect全长转录组的建库流程与普通的Iso-seq有什么区别?



  A

Connect全长转录组建库流程图如下所示:

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在mRNA逆转录之后进行cDNA的扩增,其中引物外侧连接了含有U碱基的接头序列,在扩增完成后用USER酶降解掉部分序列,形成连接末端,再用连接酶将不同的转录本连接起来。最后在两端加上PacBio SMRTbell环形接头完成文库构建。