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技术简介


安诺基因基于微流控技术的10x Genomics自动分选细胞平台,实现对单个细胞5’转录本的反转录和扩增,可同时制备单细胞5转录组文库和免疫组库V(D)J文库。10x Genomics平台能够在7分钟内完成多至80,000个细胞的自动分选,每个油滴包裹凝胶珠(GEM)中含有单个细胞和逆转录反应体系,可同时获取单细胞5基因表达数据和TCR/BCR V(D)J重排信息,深入探究细胞免疫反应的复杂性,在免疫学和免疫肿瘤学中有着广泛的应用前景。


应用领域




技术流程


技术流程

注:左侧为单细胞5转录组分析流程,右侧为免疫组库V(D)J分析流程


样本要求

送样要求

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10x Genomics单细胞测序揭示儿童结肠炎及炎症性肠病的常见机制和治疗途径


Mucosal profiling of pediatric-onset colitis and IBD reveals common pathogenic and therapeutic pathways


案例解析



人肠粘膜由单层上皮细胞、上皮内基质和免疫细胞组成。完整的上皮屏障防止未消化的食物蛋白、微生物和病原体激活免疫细胞。免疫细胞和非免疫细胞的组成和功能改变与IBD的发生有关。然而,儿童期发病结肠炎是否为IBD的危险因素以及这些疾病是否有共同的发病机制仍是一个未解的问题。

本研究利用单细胞测序和GWAS对患儿的结肠粘膜进行未分化结肠炎、克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)患儿的单细胞聚类、免疫表型和风险基因分析,找到了疾病的特异性特征,以及以cAMP反应信号受损为标志的常见发病机制,并在研究中发现通过使用磷酸二酯酶(PDE抑制剂双嘧达莫来靶向这些通路,恢复免疫稳态并改善结肠炎症状,最终揭示了儿童结肠炎和炎症性肠病(IBD常见的发病机制和治疗靶点。



设计思路


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结肠微环境的队列特征和单细胞分析


为阐述致病机制及研究药物靶点,研究团队对17名患儿(包括对照组、结肠炎和PIBD各亚型间)的结肠黏膜免疫细胞和非免疫细胞进行了单细胞转录组及TCR+BCR测序分析,得到65,367个免疫细胞和7,798个非免疫细胞的转录组数据,通过聚类分析获得9个细胞亚群,同时依据824例人群的GWAS数据发现了244个可能导致PIBD风险的基因。


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1 结肠微环境样本来源及单细胞图谱分析



上皮细胞中表达的新风险基因参与了PIBD的发病机制


研究进一步分析了肠上皮细胞、结肠黏膜成纤维细胞和血管内皮细胞、髓系细胞、免疫细胞等的亚群分布及关键基因。发现肠上皮细胞共分为10个亚群,分布着不同的PIBD风险基因。比如CDUC风险相关ERN1基因, 在干细胞、祖细胞、肠内分泌细胞中高表达,DVL1通过β-连环蛋白及WNT通路活化影响上皮细胞的再生,主要在干细胞及分泌祖细胞中表达。


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图2  上皮细胞异质性及关键基因分析


成纤维与内皮细胞异质性及关键基因分析


结肠黏膜成纤维细胞分为7个亚群,在UC样本中含有独有的炎症成纤维细胞亚群(表达IL1B IL6)。此外,PIBD血管内皮细胞中,调控血管生成及白细胞溢出相关基因明显上调,表达PECAM1CD31)的内皮细胞丰度也显著增加。


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图3  成纤维与内皮细胞异质性及关键基因分析


骨髓细胞积聚在PIBD的结肠粘膜中,并具有过度炎症性

CD68+髓系细胞进一步分为10个亚群,整体在PIBD样本中丰度更高。其中,高表达IL1BTNF-α的巨噬细胞,几乎只存在于PIBD中。在TNF+巨噬细胞中,PDE4B(降解胞内cAMP)的表达上调,胞内cAMP水平降低。研究团队通过体外实验证实临床应用PDE抑制剂双嘧达莫可提高胞内cAMP水平,显著抑制TNF-α,IL-1β和IL-6的表达。


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图4  髓系细胞异质性及关键基因分析


CD39+ IETs表现出细胞毒性和调控特征,在PIBD中大量减少

对免疫细胞相关数据进行分析,发现PIBD各亚型中,CD39CD8+γδ1+ T细胞的表达显著降低。研究进一步证实PDE抑制剂可恢复CD39T细胞中的表达,在用双嘧达莫处理三天后,CD8+ T细胞中CD39的表达明显上调。

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图5  免疫细胞异质性及关键基因分析


双嘧达莫在初步临床研究中可恢复免疫稳态并减轻结肠炎症状

对结肠黏膜细胞进行深入分析描绘后,研究团队对急性肠炎小鼠模型进行了双嘧达莫治疗,发现用药可显著提高小鼠的体重、结肠长度,提升上皮结构完整性,抑制血小板聚集和TNF-α的表达。对9例患者(8例结肠炎和1IBDU)开展双嘧达莫的小样本临床试验,发现患者各项临床指标均有明显改善。用药后,cAMP浓度升高,CD39的表达上调,血小板聚集减少,临床症状得到缓解。


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图6 双嘧达莫可缓解结肠炎的临床症状


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研究利用单细胞测序技术解析了对照组、结肠炎和PIBD各亚型间结肠黏膜免疫及非免疫细胞的异质性,深入挖掘了儿童结肠炎及炎症性肠病的致病机制,同时证实抗血小板药物双嘧达莫可激活cAMP通路,恢复免疫稳态并缓解结肠炎症状,具有良好的临床治疗效果,为儿童结肠炎及炎症性肠病的防治提供了新的见解。


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Huang, B., Chen, Z., Geng, L., et al. Mucosal profiling of pediatric-onset colitis and IBD reveals common pathogenic and therapeutic pathways[J]. Cell, 179(5):11601176.


FAQ


Q

10x Genomics 单细胞免疫组库产品对样本有哪些特殊要求?



A

物种:仅限人、C57BL/6小鼠和BALB/c 小鼠;V(D)J细胞类型:仅限T细胞、B细胞。