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单细胞全基因组甲基化测序(single-cell whole genome bisulfite sequencing , scWGBS是基于单细胞水平的全基因组DNA,对其进行重亚硫酸盐处理,结合Illumina高通量测序平台,进行的全基因组甲基化水平研究。其结果将精确解析单细胞中每一个胞嘧啶的甲基化状态。对高异质性细胞表观遗传信息的发掘有重大意义。这一技术,为揭示胚胎的发育机制,进行癌症和不孕不育的研究治疗提供了可能。


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单细胞甲基化研究母亲肥胖引起发育缺陷的机制


Embryonic defects induced by maternal obesity in mice derive from Stella insufficiency in oocytes


案例解析



母亲肥胖导致胚胎缺陷,但其机制尚不明确。研究人员通过蛋白组学比较分析了正常小鼠和 HFD 小鼠减数分裂中期 IImetaphase II MII)卵母细胞中蛋白差异,发现了卵母细胞中 Stella 蛋白的不充足可能代表了介导了母体肥胖在胚胎和后代中的表型效应的关键分子机理。


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    高脂喂养雌性小鼠胚胎表型

研究人员利用高脂喂养(HFD)雌性小鼠,发现其后代早期发育中出现一系列缺陷,主要表现在胚胎发育迟缓或阻滞。


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    1 正常小鼠 ND 胚胎与高脂喂养小鼠 HFD 胚胎表性比较


    肥胖小鼠卵母细胞 Stella 蛋白减少

利用蛋白组学技术对 HFD 雌性小鼠卵母细胞以及ND 雌性小鼠卵母细胞进行检测分析,获得一系列表达差异的蛋白。其中 Stella 蛋白(也称为 DPPA3 或PGC7)的表达在HFD 雌性小鼠卵母细胞中明显降低。通过WB 和荧光免疫检测得到了验证。


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 图2 蛋白组分析获得关键基因



    肥胖小鼠受精卵表观遗传不对称的建立受损

关于Stella 蛋白,以往研究表明其是早期胚胎发育的重要母源因子,且参与哺乳动物受精过程后的整体DNA 甲基化重塑。文章选取PN4 期(合子发育后期)ND 小鼠及 HFD 小鼠,利用 5-mC 和 5-hmC 的荧光抗原,在激光显微镜下进行观察。发现 HFD 小鼠合子细胞中,雌原核 5mC 水平明显降低,5hm 水平明显升高,但在雄原核中变化不大。


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图3 甲基化水平分析(荧光免疫检测)

    HFD小鼠受精卵甲基化的全局低甲基化

由于Stella 蛋白缺失会影响 DNA 甲基化重塑,且荧光免疫实验也获得了甲基化水平变化的信息,文章进一步选取 PN4 期 ND 小鼠及 HFD 小鼠合子细胞进行单细胞全基因组甲基化测序,发现 HFD 小鼠合子细胞甲基化水平整体降低。


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图 4单细胞全基因组甲基化分析


深入挖掘单细胞全基因组甲基化数据,获得实验组与对照组间差异甲基化区域。比如 HFD 小鼠合子细胞中,转座子区域甲基化水平显著降低,转录被激活,随着转座子的活化,可导致一系列 DNA 的损伤及不稳定,进而可能影响表型。


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图5 实验组与对照组差异甲基化分析



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研究人员通过蛋白组学比较分析了正常小鼠和 HFD 小鼠MII卵母细胞中蛋白差异,发现 HFD 小鼠卵母细胞中Stella蛋白质的显着减少,导致胚胎发育缺陷。Stella 与甲基化重塑相关, 其变化整体性影响了 HFD 小鼠合子的甲基化水平。


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Han L.S., Ren C., Li L. et al. Embryonic defects induced by maternal obesity in mice derive from Stella insufficiency in oocytes[J]. Nature genetics. 2018.


FAQ


Q

单细胞甲基化测序的覆盖度?



A

单细胞甲基化的建库过程,先对细胞进行 BS 处理,使 DNA 片段化的同时,将未甲基化的 转换为 T,然后再加接头进行 PCR 建库。由于 BS处理后,DNA 会产生损失,因此文章(Smallwood S A, et al. Nature Methods, 2014)中的覆盖度也只有 8.5%~36.2%之间。