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技术简介


10x Genomics Visium空间转录组测序解决方案可完整组织切片中细胞的基因表达数据与其所在的空间位置信息相结合,在识别不同细胞群的同时保留其原有的空间位置,这有助于理解肿瘤微环境中细胞功能、表型和位置的关系,其可应用于癌症神经科学育生物学等多种研究领域。


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Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex


Visium空间转录组技术在人背外侧前额叶皮层研究的应用


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研究背景


大脑的功能与空间结构密切相关,这种结构-功能关系在人大脑皮层的层状组织中尤为明显,其中位于不同皮层的细胞表现出不同的基因表达模式,以及不同的形态、生理和连接模式。由于与神经精神疾病相关的基因表达于特定的大脑皮层,因此,在细胞分辨率下定位人大脑中空间基因的表达对于进一步了解疾病致病机制至关重要。

本研究选择人背外侧前额叶皮层(DLPFC,一种与许多神经精神疾病有关的大脑区域)进行10x Genomics Visium空间转录组测序,绘制DLPFC基因表达的层状图谱,并利用已发表的大规模snRNA-seq研究的数据进行验证,同时提高细胞亚群注释的准确性。为了进一步临床转化应用,将本研究数据集与已发表的各种神经精神疾病基因集进行了整合,以证实自闭症谱系障碍(ASD)风险基因的优先layer-enriched表达和几种神经精神病的风险layer-enriched关联,说明了本实验数据可应用于临床转化。


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人死后的背外侧前额叶皮质(DLPFC)组织切片,12张,组织切片厚度为10μm。


研究思路



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图1 文章研究概览


研究思路


  Visium空间转录组数据统计

选取3个正常成人,分别从中获取0μm处和300μm处的2对连续的组织切片,每对连续的组织切片可作为空间重复,共12个样本,平均每张切片测序量为291.1M reads,每个spot平均检测到1734个基因和3462个唯一的UMI。平均每个spot包含3.3个细胞。在垂直于脑膜表面的平面中获取组织切片,该平面延伸至灰质和白质交界处。通过勾画第6层(L6)和相邻的白质(WM)之间的边界和通过每个组织切片的灰质/神经元、WM /少突胶质细胞和L5的标记基因(SNAP25、MOBP和PCP4)识别L5来确认每个样品的方向。


图2 空间转录组实验设计

空间转录组实验设计



  DLPFC的基因表达


通过对每个空间重复中每一层每个基因的总UMI数生成layer-enriched表达谱来进行 pseudo-bulked处理,将12个样本中的47,681个点汇总到76个分层聚合的基因图谱中, 消除了稀疏性并大幅增加了基因的UMI覆盖率。layer-enriched表达谱的无监督聚类揭示了与皮层差异(尤其是白质和灰质之间)相关的数据变化的主要成分,其在每对空间重复样本中一致性较高。利用3种Layer-level基因建模策略(ANOVA、Enrichment和Pairwise)进行差异基因分析,均显示人的成年DLPFC不同层之间广泛的基因表达差异。


图3 DLPFC中Layer-enriched 基因表达

3 DLPFC中Layer-enriched 基因表达


  鉴定人类皮层中新的 layer-enriched基因

本研究系统的评估了已发表的人和啮齿动物大脑皮层相关数据集中的marker基因在成人DLPFC layer-enriched基因表达数据集中的鲁棒性,进一步证实了与分层富集相关的典型marker基因,同时利用艾伦大脑研究所的人类大脑图谱中公开发表的smFISH数据进行验证。本研究中还找到了新的 layer-enriched 差异表达基因,并利用RNA scope进行验证。


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4 已发表的smFISH数据验证Visium数据集有效性


  单细胞核转录组测序(snRNA-seq)的空间registration

将人脑组织生成的snRNA-seq数据集增加空间分辨率,可为分子定义的细胞类型的功能提供更深入的了解。从Visium数据中富集模型中获得的layer-enriched表达谱和差异表达统计相关数据可用于snRNA-seq数据集进行空间registration,可向不包含固有解剖信息的数据驱动的表达cluster中添加layer-enriched信息。研究者利用已发表的snRNA-seq数据和bulk RNA-seq数据来验证这种策略,这表明空间registration策略可应用于任何现有的来自分离细胞的snRNA-seq或scRNA-seq数据集,以补充解剖学信息。


图5 SnRNA-seq数据空间registration

5 SnRNA-seq数据空间registration


  layer-enriched基因表达谱的临床意义


分别选取与不同紊乱疾病相关的基因集、各种脑疾病患者和正常人的死后大脑中差异表达的基因集和全转录组关联研究(TWAS)的遗传风险相关的基因集来评估空间基因表达的临床相关性,证明了ASD和SCZD(神经分裂症障碍)中涉及基因的优先layer-enriched表达,分析结果显示可通过将成年DLPFC的layer-enriched基因表达纳入风险基因的解释,以便收集临床见解。例如,ASD和SCZD中涉及的基因的优先layer-enriched表达,主要与神经发育迟缓(NDD)相关的基因在L2中优先表达,而主要与ASD相关的基因在L5中优先表达。


图6 神经发育和神经精神的基因集的Layer-enrichment

图6 神经发育和神经精神的基因集的Layer-enrichment


  DLPFC中的数据驱动的layer-enriched分群


相对于基于细胞结构的人工注释 laminar cluster,本研究评估了基于空间可变基因的数据驱动的注释方法,发现layer-enriched基因可用于人皮层的数据驱动聚类方法中,并且比以往定义的标记表现得更好。数据驱动的方法可以识别之前未知的细胞组织,也可以应用于其他形态模式,即不像大脑皮层那样明确的人组织或大脑结构。 


图7 DLPFC中的数据驱动的layer-enriched分群

7 DLPFC中的数据驱动的layer-enriched分群



参考文献


Kristen R. Maynard, Leonardo Collado-Torres, Lukas M. Weber,et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex[J]. bioRxiv, 2020.

FAQ



Q

空间转录组测序技术所需冷冻组织为什么不能直接用液氮处理?



A

原因是液氮在组织表面的沸腾会造成气穴或者冷冻不均匀进而产生爆裂或组织形态破坏。



Q

在空间转录组测序技术中,为什么建议对冷冻组织OCT包埋,而非石蜡包埋?



A

因为OCT较石蜡包埋的好处是能够较好的保存蛋白等大小分子及样本的抗原反应性。

OCT包埋剂的优势如下:

1) 可支撑切片中的组织结构;

2) 维持切片操作过程中的温度,使切片表面光滑

3) 具有水溶性,可与各类组织染色操作可兼容。