产品简介 技术流程 样本要求 案例分析 FAQ

技术简介


Hi-C技术源于染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture—3C)技术,以整个细胞核为研究对象,利用高通量测序技术,结合生物信息学方法,研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系;通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获,获得高分辨率的染色质三维结构信息,并与ATAC-seq、ChIP-seq、基因组、转录组等数据联合分析,从基因调控网络和表观遗传网络来阐述生物体性状形成的相关机制。


优势


动物Hi-C测序优势

动物群体细胞Hi-C测序应用领域




技术流程


技术路线


产品参数


Hi-C技术产品参数

 

样本要求


Hi-C技术样本要求



小鼠失活X染色体结构特征


Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse



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设计思路


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动物群体细胞Hi-C测序 蓝色 宋+A-14 研究结果.jpg


失活X染色体的结构特征

为了研究失活X染色体的结构,选取来源于高度多态性F1代小鼠胚胎干细胞的神经前体细胞做等位基因特异的Hi-C分析。首先,在胚胎干细胞中做Hi-C分析,ES细胞中还没有发生X染色体沉默;发现活跃的X染色体含有明显的活跃、 失活区室化(compartment A/B),也没有拓扑结构域结构(TAD)(图1 )。

失活X染色体的结构特征.png

图1 胚胎干细胞染色质三维结构特征


高度多态性F1代小鼠胚胎干细胞的神经前体细胞中(NPCs),在常染色质和未失活的X染色体中具有类似的A/B compartment和TAD结构;但是在失活的X染色体中没有A/B compartment(图1),而是由含有DXZ4微卫星的200kb铰链区域分割成两个大的相互作用区域;此外,在失活的X染色体中也没有拓扑结构域(TADs)(图2)。

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图2 失活的X染色体结构特征


含有DXZ4的边界、CTCF在失活X染色体的三维结构中的作用

为了研究沉默X染色体中不寻常的两个结构域的重要作用,我们删除了小鼠胚胎干细胞中来源于129亲本等位基因中含有DXZ4位点的200kb边界区域。胚胎干细胞经分化后,分离出许多含有129 亲本X染色体沉默的NPC克隆(ΔFT/D9B2克隆),Hi-C分析表明失活X染色体结构重塑导致了两个大的结构域发生融合(图3a)。ATAC-seq和RNA-seq表明,在以上分化后的NPC克隆中,87个兼性逃离沉默的基因中有66个失去了转录和染色质亲和特性(图3b)。比较D9B2和野生型NPCS 中沉默的X染色体发现,二者在沉默基因的避免、染色质亲和性缺失和TAD信号减弱有很高的相关性(图3c)。在删除含有DXZ4边界的失活X染色体中,特殊的远距离互作发生了缺失(图3d)。在野生型克隆中用ATAC-seq在沉默的X染色体中检测到的224个peak中,139个在D9B2中是缺失的(图3e);这些缺失位点富集在启动子附近含有CTCF结合位点的区域(图3f,g),这些CTCF更接近于“逃离沉默”的基因转录起始位点(TSSs),再次证明了启动子附近的CTCF在“逃离沉默”的基因调控中发挥着重要作用(图3h)。


含有DXZ4的边界、CTCF在失活X染色体的三维结构中的作用.png


含有DXZ4的边界、CTCF在失活X染色体的三维结构中的作用.png

图3 含有DXZ4的边界、CTCF在失活X染色体的三维结构中的作用


Xist在失活X染色体特殊的三维结构重塑中的作用


在未分化的雄性小鼠ES细胞中诱导Xist表达,Hi-C分析发现诱导Xist 48小时导致X染色体结构发生明显变化(图 4a-b);但是在不含A重复区域的Xist突变样品中,基因不发生沉默,染色体三维结构没有变化。野生型Xist诱导不会导致TAD结构的显著改变,但是会导致染色体相互作用频率的增加(图4d), Mb级别的结构域分割边界用RNA/DNA FISH验证是正确的(图4c)。


Xist在失活X染色体特殊的三维结构重塑中的作用.png

图4 Xist在失活X染色体特殊的三维结构重塑中的作用




研究结论


本研究揭示了失活X染色体的三维结构特征,为研究染色体结构和基因表达的关系提供了强有力的方法,将帮助科学家们更多地了解活细胞中基因组的运作情况;同时有助于开发新的方法,对抗女性X染色体相关的疾病,促进相关疾病的研究与治疗。



参考文献


Giorgetti L, Lajoie B R, Carter A C, et al. Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse [J]. Nature, 2016, 535(7613): 575-9.


FAQ



Q

Hi-C是否需要设置多个重复?



A

理论上最好能做2-3个生物学重复;但从实际样本需求量和成本角度考虑,可以让步做2个以上的技术重复。例如一个样本理论上需要测300 G数据量,实际进行项目时可以2个文库每个测150 G数据量,或者建3个文库每个测100 G;在生信分析中进行样本间数据相关性分析,确认相关性高之后再把几个文库的数据整合进行后续分析。



Q

一个样本的Hi-C数据测多少合适?分辨率或bin size的意义是什么?



A

针对不同的研究目的,Hi-C所需的数据量标准也会不同。安诺Hi-C产品对此有一套合理的计算方法,综合考量到物种基因组大小、分辨率、文库质量、测序策略等多种因素。如有需要,可以向我们的当地工作人员咨询细节。

Hi-C对于不同基因组区域间互作分析的准确程度,通常用分辨率来描述,其衡量单位是分析中数据有效支持的基因组等分滑窗大小(bin size)。在“有效”的bin size下,80%-90%以上的bin两两之间存在reads支持的互作关系,才能认为此分辨率是可达到的。需要注意的是,分析中使用的bin size可以随意调整大小,但必须有足够数据支持才能证明其有效;如果数据量不足,太小的bin彼此间没有互作关系,并不能认为是达到了此分辨率。



Q

样品交联后检测出现降解、DNA-蛋白复合物少怎么办?



A

1) 首先要保证样本新鲜。交联前保存不当,发生降解或冻结,DNA-蛋白互作会被破坏。

2) 组织样本用于建库,需要离体后短时间内尽量剪碎进行交联,保证交联充分。

3) 交联反应要合理控制。交联温度应保持25℃左右。甲醛处理时间过长、未及时中止交联也会导致样本降解。