产品简介 技术流程 样本要求 案例分析 FAQ

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细菌宏基因组测序是以特定环境中整个细菌微生物群落作为研究对象,不需对环境中细菌微生物进行分离培养,而是通过提取环境中整个细菌微生物群落的总DNA,利用Illumina HiSeq测序仪进行高通量测序,并进行生物信息学分析,来研究细菌微生物与环境、与宿主相互之间的关系,它摆脱了传统研究中微生物分离培养的技术限制。二代高通量测序平台具有通量高、准确性高、速度快、信息全等特点,能够显著加快宏基因组学研究的进程,并且在鉴定低丰度的微生物群落及种类,挖掘更多基因资源方面具有非常大的优势,完全能够满足常规微生物群体的物种分类研究、群落结构、系统进化、功能注释,样品间的物种或基因差异以及物种间的代谢网络等分析。通过深度挖掘具有应用价值的基因资源,为研究和开发新的微生物活性物质提供有力支持。


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球海洋微生物的结构和功能


Structure and function of the global ocean microbiome


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设计思路


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研究结果


Tara 海洋微生物样本中获得的新基因的多样性



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图1 海洋微生物参考基因目录


建立了一个全球海洋微生物内参基因目录(OM-RGC),包含>4000万个来自病毒、原核生物、微型真核生物的非冗余,且大部分为新发现的基因,约为人体肠道微生物内参基因目录数目的4倍,大部分为细菌中的基因。

(A)通过对来自68个地点的243个样本3µm以下的病毒和微生物进行宏基因组测序,组装和基因预测,鉴定出>111.5M的基因编码序列,聚类到>40M的参考基因上的序列>26M(外源基因)(左上图)。而目前肠道微生物参考基因目录才10M(来自1,070个个体的1,267个样本)(右上图)。结合从公共资源中获得的数据,对海洋微生物的基因进行聚类注释,结果显示超过81%的基因只在本研究的样本中发现,且参考基因目录主要有细菌基因组成(左下图)。(B)样本增加与新发现基因数稀释曲线。小图139个海洋原核样本对比相同数量人肠道微生物的稀疏曲线,发现具有更丰富的遗传多样性。(C)139个海洋原核样本中新发现的基因(红色)与能比对到已有公共数据库上的基因(蓝色)比例。


海洋微生物的深度层级分布


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图2 海洋微生物在不同深度水层中分布分析


(A)基于139个原核生物16S测序数据的主成份分析发现样品中微生物丰度在不同深度水层中显著分离;盒形图分析发现表层水与深层水的微生物差异显著,与中层水的差异较小。(B)20个不同地点取样分析表层水、深层水和中层水中微生物物种丰度和细胞密度,发现随着水深增加,微生物的物种丰度升高,而细胞密度降低;基因功能和丰度随深度加深而增加,而样品间的差异降低。相对于表层水的微生物,预测中层水最短微生物群体世代间隔更长。


海洋微生物群落横向的多样性与垂直距离的衰减


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图3 海洋微生物群体纬度相关的多样性和随距递减


(A)物种丰度与温度的关系显示出随温度升高至15℃,物种丰度增加;温度继续升高则物种丰度逐渐降低。颜色表示处于不同的纬度,可以看出海水中微生物丰度最高的区域是在中纬度,而不是赤道附近。方块和圆圈分别表示样本来自于南半球和北半球。(B)样品采集点两两之间距离与微生物群结构的差异,显示样品采集点之间距离在5000km之内时,微生物群体结构随距离增加而差异增大(只计算海洋区域的距离)。


海洋表面的微生物群落组成的环境的驱动因素



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图4 环境对表层水中微生物组成的影响


(A)主成分析发现表层水中微生物随区域聚集的趋势并不明显(上),反而随着所在地的温度而分离,第一主成份和温度之间显示强关联性(R2:0.76)。(B)运用斯皮尔曼相关系数展示环境因素之间两两比较。基于三种独立的分类方法:16S的mitags、mOTU和功能(KEGG模块)组成与环境因素采用曼特尔检验进行相关性分析。


对海洋表层的139个原核生物样本进行PCoA分析发现,温度和溶氧量是影响原核生物分类和功能组成的主要因素,其中温度的相关性更大,温度是影响表层水中微生物组成结构的主要因素;随着纬度的升高,物种丰度呈现先升高后降低的趋势,峰值出现在中纬度区域。


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图5 温度是影响浅层水中微生物组成结构的主要因素


(A)  宏基因组与环境因素的关联强度。(B)微生物种类构成与实地温度的关联强度。


海洋微生物与肠道微生物核心直系同源簇的差异比较


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图6 海洋和人肠道核心同源微生物


(A)从1-139个随机样本中同源微生物(orthologous groups, OGs)统计。随着样本量的增加,同源群数先快速下降,然后缓慢下降逐渐接近139个样本时的5755个OGs。(B)海洋和人肠道核心同源组的功能对比。海洋组中有40%位置功能,而人肠道组只有9%。海洋核心同源组又被分为了普通组,不常见组和罕见组。(C)海洋和人肠道核心同源组的基因丰度对比,显示两个不同的生态中的微生物基因在功能质量和数量上都有很大的交叉。


海洋微生物功能结构的组成


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图7 海洋微生物的功能结构


(A)海洋微生物的门水平上的种类多样性相对与功能组成更加丰富(上);非核心基因功能占总基因丰度的比例(下)。(B)表层水中微生物核心同源组几乎完全被中层水微生物核心同源组所包含(左);表层水中微生物标记基因丰度与中层水中的差异。

 

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研究结论


全球范围内不同位置海洋宏基因组的研究促进了对海洋模型的预测,发现了环境温度对海洋微生物群落结构变化的驱动作用,揭示了全球不同海域海洋功能的相似性,对研究气候变化具有广泛的意义,也为研究海洋微生物之间及微生物与环境互作提供方法理论基础。Tara Oceans项目不仅有利于全面研究海洋生态系统,其中对微生物群落结构的研究也有助于更加深入的研究海洋生态环境。Tara海洋项目对生态系统的发展过程理解的促进作用,不仅在于海洋生态,也通过生态系统之间的比较分析,促进了对所有微生物群的研究。


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参考文献


Sunagawa S, Coelho L P, Chaffron S, et al. Structure and function of the global ocean microbiome[J]. Science, 2015, 348(6237): 1-9.

Q微生物群落多样性分析与宏基因组测序的区别有哪些?


A微生物群落多样性分析是通过研究细菌16S rRNA基因进行高通量测序与生物信息学分析,来研究样品中微生物的物种分类、丰度以及系统进化。宏基因组测序是以环境样品中的微生物群体基因组DNA为研究对象,直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,进行高通量测序与生物信息学分析,来获得环境样品所包含的全部微生物的群体基因组成及功能、参与的代谢通路,分析微生物群体的多样性与丰度,研究微生物与环境、与宿主之间的关系,发掘与研究新的或者具有特定功能的基因。


Q宏基因组测序总DNA的提取有哪些注意事项?


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获得高质量的环境样品总DNA是宏基因组测序能否成功的关键。为了提取的DNA能够代表特定环境样品中的微生物种类,取样时必须严格遵循采样标准,尽量避免对样品的干扰,缩短保存与运输的时间,以尽可能地保持样品的微生物原貌。若要对功能基因簇进行研究,在提取DNA时,既要尽量完全地抽提出样品中的DNA,又要使获得的DNA保持较大的片段,因此在DNA提取时要在最大提取量与最小剪切力之间进行折衷。


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