产品简介 技术流程 样本要求 案例分析 FAQ

技术简介


DNA甲基化是重要的表观遗传学标记信息,获得全基因组范围内所有C位点的甲基化水平数据,对表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。Bisulfite甲基化测序是以新一代高通量测序平台为基础,结合全基因组Bisulfite处理和生物信息数据分析技术,进行低成本、高效率、高准确度的全基因组DNA甲基化水平图谱绘制。


优势


全基因甲基化测序优势


全基因甲基化测序应用领域



技术流程


全基因甲基化测序技术流程


产品参数


全基因组甲基化测序产品参数


样本要求


全基因组甲基化测序样本要求




案例解析


慢性缺氧诱导Cirbp高甲基化减弱低温心脏保护作用


Chronic hypoxia–induced Cirbp hypermethylation attenuates hypothermic cardioprotection via down-regulation of ubiquinone biosynthesis



案例解析


设计思路


设计思路



研究结果


低氧个体中CIRBP影响低温心肌保护作用

存在慢性缺氧(CH)症状的心脏疾病患者,在低温保护的CPB心脏手术中更易出现心肌损伤。研究者为了分析两者关联性的内在机制,构建了慢性缺氧大鼠模型(CH大鼠)以评估其心肌在CPB过程中的受损情况。对CPB处理的CH大鼠和普通大鼠心脏进行蛋白质组分析发现,一种冷休克蛋白CIRBP的表达在CH组中受到明显的抑制。

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图1 CH组因心脏损伤产生左心室压异常(左),蛋白质组显示其CIRBP表达降低(右)


低氧个体中CIRBP影响低温心肌保护作用

根据前期资料,研究者推测低温缺氧环境可能会影响心肌组织的DNA甲基化水平,并用全基因组甲基化测序(WGBS)进行了验证。结果发现CH大鼠心肌组织DNA甲基化水平较常氧个体显著提高,而Cirbp基因的启动子区存在的一处CpG岛发生了显著的甲基化水平提升,影响转录因子SP1结合,导致基因表达水平降低。


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图2 CH组与对照组基因组整体(左)和Cirbp启动子区(右)的DNA甲基化水平比较

CIRBP通过影响泛醌合成调控低温心脏保护作用

研究者进一步构建了Cirbp基因敲除的大鼠模型,发现其心肌组织中泛醌(CoQ10)合成途径受到干扰,导致心肌ATP下降。在心脏停搏液中加入CoQ10能够有效提高CH大鼠模型的低温心脏保护作用,具有潜在的临床指导意义。


图3 Cirbp基因敲除大鼠心肌中,泛醌生物合成通路相关蛋白表达下调

图3 Cirbp基因敲除大鼠心肌中,泛醌生物合成通路相关蛋白表达下调


研究结论


该研究借助生物模型,应用WGBS、RNA-seq、蛋白质组等多种手段,发现Cirbp启动子区高甲基化导致表达下调、最终引发CoQ10合成受阻可能是导致慢性缺氧患者在心脏手术中心肌受损的原因,并提出了在临床上进行改进的潜在手段。


参考文献


Liu Y, Xing J, Li Y, et al. Chronic hypoxia-induced Cirbp hypermethylation attenuates hypothermic cardioprotection via down-regulation of ubiquinone biosynthesis[J]. Sci Transl Med, 2019, 11(489).

FAQ


Q

WGBS对于物种有什么要求?



A

如果物种有以下情况,可能不适合进行WGBS:

1) 基因组甲基化修饰率(5mC)很低的物种。已报道的低甲基化率物种包括:果蝇等双翅目昆虫、面粉甲虫、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、线虫和黄曲霉。这些物种基因组5mC修饰很少,可挖掘到的信息不多。

2) 参考基因组组装质量较差的物种。WGBS数据的比对对于参考基因组的组装质量要求较高,通常建议使用组装到染色体级别的参考基因组。如果物种基因组仅到Scaffold水平,会影响到比对质量。

3) 基因组存在复杂因素的物种。有些物种基因组存在GC含量偏高、杂合度偏高、多转座子、多重复区域等情况,都会影响WGBS数据的比对质量。



Q

WGBS推荐数据量多少?需要设置生物学重复吗?



A

通常WGBS甲基化建议测序数据量至少为30×基因组大小,生物学重复为2-3个。因为低质量reads、非唯一比对reads、重复reads等因素,实际可用数据会少于下机数据,对于参考基因组质量较差、基因组复杂、样本量较少等情况,建议适当提高测序数据量以保证最终分析结果可信。



Q

Bisulfite处理后非甲基化C是否都会被测为T?未转化的比例如何计算?



A

在文库构建过程中,会向样本中混入少量没有5mC的λDNA;根据比对到λDNA的数据中C碱基未发生C-T转化(仍被测序为C)的比例,即可计算转化率。按照安诺的成熟实验流程,按此方法计算得到的非甲基化C碱基转化率在99.5%左右,确保达到生物信息分析要求。

对于植物样本,有些文章会利用叶绿体DNA(5mC修饰水平极低)计算转化率。由于叶绿体基因组序列和甲基化修饰水平具有物种差异,安诺分析流程并未使用此方法。用此法计算转化率所得结果可能和λDNA计算得到的结果有少量偏差,属于正常情况。