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RNA提取又不合格?那你一定需要了解这些~

2017-08-31 安诺基因

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你是不是和上面的师弟有一样的苦恼,搞不定RNA这个磨人的小妖精,经常出现辛辛苦苦提的RNA又降解了,质检又没通过的情况。为什么提的RNA总是不合格? 今天作为师姐的小编就给大家梳理一下RNA提取时的注意事项,轻松帮你搞定傲娇的RNA分子,So easy~


为什么RNA易降解?


RNA容易降解有内因也有外因,从自身结构来说RNA是单链分子,本身很不稳定,另外RNA分子2’位置上有游离的羟基,易形成2’,3’-环形磷酸盐中间产物,易分解。从外因来看RNase无处不在,并且RNase本身热稳定性高、不容易失活。RNase就像顽强的小强,怎么打都不死


RNA提取注意事项
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Point 1:材料的取用与保存

 取用原则:“现用现取”,材料离体后尽快进行RNA提取。

 保存条件:液氮、-80℃冰箱、干冰。

 保存效果:液氮> -80℃冰箱>干冰。

 样品分装:按实验需求最小量保存多份,避免反复冻融。

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                               液氮                                     -80℃冰箱                                     干冰

Point 2:实验器具使用

在RNA提取过程中凡是与RNA接触到的器皿都必须是RNase-free的,具体可通过以下两种方式获得:

DEPC处理失活RNase:用含有DEPC的水浸泡实验器皿失活RNase,然后进行高温灭菌。

 
直接购买RNase-free的实验耗材:适用于经费充足的实验室,放心可靠。

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枪头                                                             研钵


Point 3:提取方法选择

RNA提取最常用的是TRIzol法和试剂盒法,二者各有优劣,可根据研究目的进行选择。

试剂盒法:

优点:操作简单、入门容易,新手必备。

缺点:柱提取法提取的RNA有长度的局限性, 小RNA在提取过程中容易丢失。另外,不同的试剂盒适用物种不同,使用时需谨慎选择。

TRIzol法:

优点:提取成本低,适用物种广泛,操作者可根据不同实验材料的特点灵活调整实验步骤达到最优的提取效果,适用于经验丰富的科研老司机。

缺点:操作步骤繁琐、耗时长。

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TRIzol                                                      提取试剂

Point 4:实验人员操作

提取RNA时应配戴口罩和手套,避免皮肤上的RNase污染样品。

 实验过程遵循操作快、加样准的原则。

 建议提取经验不足的实验人员避免一次性操作几十个RNA样品,容易造成不同样品间的平行性差,另外,操作时间增长也会增加RNA降解的风险。


Point 5:RNA实验环境搭建

最好搭建RNA专用的实验环境包括实验台和离心机等,减少不同实验环境下RNase的交叉污染。

 避免将RNA长时间暴露于高温环境。通常情况下,RNA 分子自身常常发生折叠形成稳定二级结构,避免被降解,高温环境有助于RNA分子二级结构的打开,使RNA变得不稳定,因此要避免。


为什么RNA品质很重要?


RNA降解后产生不同长度的片段,利用poly A富集方法进行建库,即使抓住了3’端poly A尾也无法获得完整的mRNA- 5’端,后续的测序数据也会因为降解而产生偏差。基于三代测序技术的全长转录组测序,无需拼接直接获取RNA分子从5’端到3’poly A尾的全长序列,因此对RNA的品质要求更高,小编在此附上全长转录组测序送样要求。有了高质量的RNA样品,后续才能获得高质量的测序数据,你离高分文章又近了一步。


那高分文章怎么发,小编已经在之前的推送中告诉过各位,赶快复习起来~(同样是全长转录组测序,为什么隔壁实验室可以发高分文章


全长转录组测序送样要求


师弟,看了师姐的实验小诀窍有没有重新燃起征服RNA这个小妖精的斗志呀?撸起袖子加油干啦~师姐等着和你一起看电影哦~

 

安诺基因在全长转录组测序项目中积累了丰富的项目经验,拥有成熟的建库和数据分析流程,近期安诺基因将会引入PacBio Sequel测序平台,我们会利用领先的二代及三代测序平台,为大家提供高质量的测序服务,满足广大科研工作者们的研究需求,一切只为助力科研。

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