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三代测序送样指南—DNA篇

2018-07-04

在上一期的三代测序送样指南—RNA篇中,小编分享了全长转录组测序对RNA的样品要求和制备方法。众所周知,三代测序技术的另一大类应用是基因组层面的de novo组装和重测序;而高质量的DNA又是基因组测序成功的关键所在。那么,什么样的DNA才能符合三代基因组测序的要求?这样的DNA又该怎样获得呢?敲黑板!小编来给大家划重点啦。


1、对于三代测序来说,什么样的DNA质量符合三代测序的要求呢?

总量

DNA ≥8 μg

浓度

≥80 ng/μl

OD260/280

1.8-2.0

OD260/230

2.0-2.5

完整性

基因组DNA主峰   ≥30 kb,无降解


2、那么该如何判断DNA是否降解了呢?

以Agilent 4200 Bioanalyzer分析为例:基因组DNA降解后,其主峰对应的DNA片段大小远小于高质量DNA的主峰大小。此外,降解后的DNA主峰强度较低且峰型不好。


2-2.png

图1:合格DNA样本与降解DNA样本完整性检测峰图


3、如何处理组织或细胞样本才能获得高质量DNA呢?

同RNA提取一样,高质量DNA的提取也要求对组织或细胞样本进行适当的预处理。小编在此罗列出不同样本的处理方法,请大家依照样本类型作对应处理:


植物组织样本

植物样本在取材后需用70%乙醇或无菌水将表面冲洗干净并吸干。将组织用液

氮或-80°C速冻后放入预冷的50 ml离心管,或用锡箔纸包裹后放入自封袋中,干冰运输。


每文库需要植物组织干重≥2 g


Tips:取材时应优先选取新鲜的幼嫩叶片或芽茎,而不是富含多糖多酚的老叶片或果实。大型菌(如蘑菇和灵芝)也需按此方法处理。


动物组织样本

动物组织应在生物体死亡10分钟内取材,并使用预冷的生理盐水或PBS漂洗。在冰上快速剔除结缔和脂肪组织后,将样品分割成如黄豆粒大小的小块(约50 mg)并吸干。最后,将样品放入无酶的1.5/2.0 ml EP管中,液氮或-80°C速冻,干冰运输。


每文库需要动物组织干重≥1.5 g


Tips:应优先选取DNA得率较高的肝脏等组织,而不推荐得率较低的肌肉组织。


血液样本

血液取样推荐使用EDTA抗凝采血管直接收集新鲜的全血样本。待温和颠倒混匀10次后,液氮或-80°C速冻并干冰运输。


每文库需要全血体积≥5 ml(红细胞无核)或≥1 ml(红细胞有核)


Tips:取样时应避免凝血,并且不可使用肝素抗凝。


培养细胞样本

收集培养结束的悬浮细胞,并离心去除培养液;对于贴壁细胞,可用酶消化或细胞刮收集。将收集的细胞用PBS快速洗2次后,低速离心除去PBS。将细胞移入无酶的1.5 ml EP管中,离心去除上清后用液氮或-80°C速冻,干冰运输。


每文库需要≥5×107个细胞


Tips:对于体积较大的细胞(如肌纤维或神经纤维细胞),应适当增加细胞量。


微型藻样本

对于微型藻,应收集新鲜的藻体并转移至无酶的1.5 ml EP管中。用0.3 M EDTA溶液或70%乙醇洗涤后,去除上清并置于液氮或-80°C冰箱中速冻,干冰运输。


每文库需要藻体≥2 g


菌类样本

对于非大型菌类,应收集对数生长期的菌体,并尽量除去培养基等杂质。

具体而言,对于液体培养的菌类,取适量菌液转移到离心管中,以5000 rpm的转速室温离心5分钟并去除培养液,用无菌水或PBS清洗2-3次后去除上清。而对于固体培养的菌类,应选用细胞刮等适当工具从表面刮取菌体并收集到无酶的EP管中,避免刮到培养基。将收集的菌体置于液氮或-80°C冰箱中速冻,干冰运输。


每文库需要菌体≥2 g


以上就是三代测序的DNA样本送样指南,相信按照这些建议处理样本,并依托安诺优达强大的实验和分析平台,大家一定会收获满意的数据结果。


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