项目文章| Cell再现力作,体外培养人类多能干细胞与猴胚嵌合体
2021.04.30


2021年4月16日,昆明理工大学的季维智院士、谭韬教授、牛昱宇教授携手索尔克生物研究所的Juan Carlos Izpisua Belmonte在Cell上发表题为“Chimeric contribution of human extended pluripotent stem cells to monkey embryos ex vivo”的文章,其中安诺优达为此项研究提供了单细胞转录组测序服务。

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研究背景

多能干细胞(PSC)是一类能自我更新并产生所有成年细胞类型的细胞。人多能干细胞(hPSC)的种间嵌合体形成是评估体内hPSC多能性的有效途径,具有潜力为再生医学应用提供大量体内生成的人类细胞,组织和器官,包括器官移植。以往研究多使用小鼠等啮齿类与人类进化距离遥远,伦理问题轻的物种的胚胎进行嵌合体研究,但是经过多方的共同努力,hPSC在与人类进化距离遥远的物种中并不能强有力地促进嵌合体的形成。

与以往研究不同,本篇文章首次在体外制造出了由人类多能干细胞(hEPSCs)和食蟹猴(Macaca fascicularis)胚胎细胞组成的“嵌合体”胚胎,提升了hEPSCs体外生存、增殖水平,并在猴子胚胎内分化了几个细胞谱系,将此嵌合体胚胎在体外存活时间提升至20天。该研究还发现了种间串扰背后的信号事件,这可能有助于塑造嵌合胚胎内人和猴细胞的独特发育轨迹。这些结果可能有助于更好地理解人类的早期发育和灵长类动物的进化,以适应进化距离遥远的物种。

技术路线



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研究内容

01

体外人猴嵌合胚胎培养



为获得人猴嵌合胚胎,在食蟹猴早期囊胚(受精后6天[d.p.f.6])中注射25个标记有tdTomato(TD荧光的iPS1- EPSCs。一天后,在所有d.p.f.7猴子囊胚中均检测到TD+iPS1-EPSC(100%,n=132)。追踪嵌合胚胎发育,尽管随着培养时间的增加,带有 EPSC 荧光蛋白的胚盘占比逐渐变低,但在d.p.f.13,依旧有接近 40% 的胚盘中存在 hEPSCs。同时,与对照组相比,EPSC 引入导致的人猴嵌合仅仅稍微降低胚盘的存活率。

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图1. 人猴体外嵌合体的产生和发育能力


02

体外人猴嵌合胚胎EPSC分化研究



为研究EPSC 在胚盘中的存活以及发育情况,对不同时间点的胚胎和胚外谱系的特异性抗体进行免疫荧光(IF)研究。结果显示:随着时间的推移,不断分化的EPSC依次出现在猕猴胚胎的内细胞团、上胚层(标志物:OCT4)、下胚层(标志物:PDGFRa)、原肠胚(标志物:SOX17)中整体而言,在整个猕猴胚胎的培养过程中,在上胚层与下胚层中都有着一定数量的 EPSC,表明了人猴嵌合现象的存在。hEPSC对EPI表现出合理的贡献(在d.p.f.15观察到的最大贡献为7.08%),对HYP的贡献相对较低(在d.p.f.19观察到的最大贡献为4.96%),对TE的贡献有限(图2G)。

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图2. hEPSCs有助于植入期和植入后猴胚胎嵌合体的形成

03

人猴嵌合胚胎的转录图谱



为了进一步描述人猴嵌合胚的发育轨迹,进行scRNA-seq分析以描绘人和猴细胞在不同发育阶段的转录组。胚胎解离为单细胞后,使用荧光显微镜手动收集单个人(TD+)和猴(TD-)细胞,并进行scRNA-seq测序。在离体培养的不同时间点,对从嵌合体胚胎分离的227个人和302猴细胞进行了测序(d.p.f.9–d.p.f.17)。严格过滤后,将200个人类细胞和272个猴细胞用于进一步分析。每个细胞平均检测到9,798个基因和27,936,953个reads。与已发布的猴子和人类胚胎细胞的scRNA-seq数据集进行比较。

首先对scRNA-seq数据集进行了t-SNE分析,所有样品(嵌合和对照胚胎)中都存在的四个主要细胞簇:上胚层(EPI)、下胚层 (HYP)、滋养外胚层(TE)以及胚外间充质细胞 (EXMC)(图3A,3B)。这些细胞类型在嵌合胚胎中的存在表明宿主胚胎的发育基本上不受注射的hEPSC的影响,这与形态学分析是一致的(图1B和1D)。有趣的是,系统发育树分析表明,尽管人猴嵌合胚胎中人类细胞也呈现出了 4 个细胞群,但其上胚层细胞、下胚层细胞以及滋养外胚层细胞之间的界限并没有猕猴细胞那样明显。总之,这些结果表明,将hEPSCs引入猴早期胚胎,然后进行离体胚胎培养后,能够分化成不同的细胞种类。

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图3. 人猴嵌合胚胎的转录景观


04

人猴嵌合胚胎发育过程中hEPSCs的转录组动力学分析



所有细胞分化成三个分支:EPI,HYP和TE(图4A)。嵌合人类细胞与对照人类细胞和猴细胞相关系数分别是0.460与0.459,非常相近(图4B,右图)。有趣的是:与对照人类细胞相比,嵌合人类HYP细胞和EXMC细胞与嵌合猴HYP和EXMC细胞具有更高的相关系数(图4C)。综上所述,这些结果表明,嵌合体中猴与人细胞之间转录状态存在相互影响。

对基因与信号通路进一步分析探究嵌合体人猴基因表达影响模式,与对照胚胎相比,嵌合胚胎中有更多的配体-受体相互作用(图4F) 。嵌合胚胎中增强的几种信号传导途径(例如,PI3K-Akt和MAPK信号传导途径)以及新的信号传导途径(例如,WNT信号传导途径)(图4G)。总之,结果表明嵌合胚胎内细胞之间的相互作用得到加强,并可能导致其他信号通路的激活。


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图4. 人猴嵌合胚胎的发育轨迹

05

嵌合人上胚层(EPI)细胞发育轨迹分析



对嵌合胚胎及对照胚胎不同时间段上胚层(EPI)细胞进行分群(图5A),转录速率分析(图5B),发现嵌合人EPI细胞的分化比宿主猴,对照猴和人胚胎的EPI细胞分化更慢(图5C)。这些结果表明,与人类胚胎、或者猴子胚胎中真正的胚胎细胞相比,EPSC 分化成类上胚层细胞的效率更低,速度更慢。

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图5. 人猴嵌合胚胎中人EPI细胞的发育轨迹

本研究首次实现了人猴胚胎的嵌合,且延长了体外培养时间,达到了20天。另外利用单细胞转录组技术对嵌合体人猴细胞之间的交互方式进行了探讨,将有助于小鼠,猪等与人类进化距离遥远的物种的胚胎进行嵌合体研究。由于各种原因,包括社会,经济和伦理等原因,它们可能更适合于再生医学转化疗法。整体而言,本研究如耶鲁大学干细胞生物学家Alejandro De Los Angeles所说:“该论文是干细胞和种间嵌合体领域的里程碑”。

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安诺单细胞测序技术总览


参考文献:

Tan T, Wu J, Si C, et al. Chimeric contribution of human extended pluripotent stem cells to monkey embryos ex vivoCell. 2021 Apr 15;184(8):2020-2032.e14. 

doi: 10.1016/j.cell.2021.03.020. PMID: 33861963.


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安诺基因作为单细胞测序技术国内最早的服务提供商之一,从传统单细胞测序到10x Genomics高通量单细胞测序;从单细胞转录组学至基因、表观、蛋白质的多组学平台;从常规转录组测序到空间转录组测序,涵盖三大组学,九大单细胞产品。为您的单细胞科研之路扫平障碍。